韩连书  王斐  胡宇慧  叶军  邱文娟  张雅芬  高晓岚  王瑜  金晶  顾学范

　　【摘要】 目的 对甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症患儿进行临床诊治分析及基因突变检测。方法  诊断主要依靠串联质谱检测血中的丙酰肉碱水平、气相色谱-质谱检测尿中甲基丙二酸水平及血同型半胱氨酸水平；治疗给予维生素B12、甜菜碱、左旋肉碱、叶酸及维生素B6；基因突变分析应用聚合酶链反应（PCR）对MMACHC基因外显子扩增，直接测序。结果 14例患儿中12例经治疗后，临床症状明显好转，血中丙酰肉碱、同型半胱氨酸及尿中甲基丙二酸显著降低，2例患儿放弃治疗死亡。12例患儿检测到5种MMACHC基因突变，2例未检测到突变。7例为609G>A纯合突变，5例为609G>A伴658_660delAAG（2例）、567_568insT、394C>T 和217C>T杂合突变，其中656_658delAGA和567_568insT为尚未报道的突变。结论 甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症患儿经合理治疗可达到较好的临床效果。基因突变检测表明609G>A为中国患儿的热点突变。上海新华医院儿童内分泌科韩连书

　　【关键词】 甲基丙二酸血症；同型半胱氨酸血症；诊断；治疗；基因突变

　　Clinical and gene mutation analysis in Chinese patients with Methylmalonic acidemia and homocystinemia

　　HAN Lian-shu, WANG Fei, HU Yu-hui, YE Jun, QIU Wen-juan, ZHANG Ya-fen, GAO Xiao-lan, WANG Yu, JIN Jin，GU Xue-fan. Department of Pediatric Endocrinology and Genetic Metabolism, Shanghai Institute of Pediatrics, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai, 200092, China.

　　Corresponding auther: GU Xue-fan: E－mail: guxuefan@online.sh.cn

　　【Abstract 】 Objective  Methylmalonic acidemia and homocystinemia is an inborn error of cobalamin metabolism with an autosomal recessive mode. The cb1C type is the most common of this disease, of which gene was named MMACHC. This study aimed to analysis the diagnosis, treatment and gene mutations in 14 Chinese patients. Mothods  The diagnosis of this disease mainly depends on the measurement of C3 (acylcarnitine), C3/C0(free carnitine) and C3/C2(acetylcarnitine) in the blood by tandem mass spectrometry, the detection of methylmalonic acid in the urine by gas-chromatography mass spectrometry, and the determination of total homocysteine in the serum. These patients were treated with vitamin B12, L-carnitine, betaine, folic acid and vitamin B6. The MMACHC gene was screened by polymerase chain reaction (PCR) combined with DNA direct sequencing in 14 Chinese patients. Results The clinical symptoms of 12 patients have been improved obviously; the levels of propionylcarnitine and homocysteine in the blood have been decreased, as well as the level of methylmalonic acide in the urine. Two patients were dead without treatments. In this study, we detected five different mutations in 12 patients, one patient was only found one polymorphism, and another patient wasn’t detected mutation. We found 609G>A were homozygotic in 7 patients, and heterozygotic with 658_660delAAG、567_568insT、394C>T and 217C>T in 5 patients, in which the 658_660delAAG and 567_568insT were novel mutations. Conclusion  The patients with methylmalonic acidemia and homocystinemia could have a better outcome after reasonable treatments. The gene mutations detection suggested that the 609G>A (W203X) may be the hot spot mutation of MMACHC gene in Chinese patients.

　　【Key words】 Methylmalonic acidemia; Homocystinemia; Diagnosis; Treatment; Gene mutation

　　甲基丙二酸血症（methylmalonic acidemia, MMA）是一种常见的有机酸血症，属于常染色体隐性遗传病。主要是由于甲基丙二酰辅酶A变位酶或其辅酶腺苷钴胺素缺陷所致。甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症（Methylmalonic acidemia and homocystinemia）是甲基丙二酸血症中钴胺素代谢缺陷的一种类型，包括cb1C、cb1D和cb1F三种亚型，这3种亚型均可导致腺苷钴胺素和甲基钴胺素合成不足，引起相应的甲硫氨酸合成酶和甲基丙二酰CoA变位酶活性降低，从而使体内甲基丙二酸及同型半胱氨酸蓄积，造成神经、血液、肝脏、肾脏和皮肤等多系统损伤。其中以cb1C型最为常见，编码基因为MMACHC（OMIM 277400），迄今已发现40余种突变[1]。现对2004~2007年确诊为甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症的14例患儿进行临床及基因突变分析。

　　对象和方法

　　一、对象

　　甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症患儿14例，男6例，女8例。主要以反复呕吐、抽搐、纳差、嗜睡或生长发育落后就诊，父母非近亲婚配。所有检查均获得患儿家长的知情同意。

　　二、方法

　　1.  血酰基肉碱测定：采用串联质谱技术（tandem mass spectrometry, MS/MS）检测血液中游离肉碱（free carnitine, C0）、乙酰肉碱（acetylcarnitine, C2）和丙酰肉碱（propionylcarnitine, C3）水平，并计算C3/C0和C3/C2比值[2]。标本采集用干血滤纸片法，检测方法参考文献[3]报道的方法。串联质谱仪为美国生物应用系统公司产品(API 2000型)。

　　2.  尿甲基丙二酸测定：采用气相色谱-质谱技术（gas-chromatography mass spectrometry, GC-MS）。检测方法参考文献[4]报道的方法，为半定量法，检测值为甲基丙二酸与内标17烷酸的比值。仪器为日本岛津公司产品(QP2010)。

　　3.  血清同型半胱氨酸测定：通过荧光偏振免疫法测定血清同型半胱氨酸[5]。

　　4.  维生素B12负荷试验：每天肌注1mg，连续3天，通过治疗前后血C3、C3/C0、C3/C2及尿甲基丙二酸水平变化，观察患儿对维生素B12治疗的有效性。

　　5.  基因检测：取患儿及其父母外周静脉血，采用苯酚-氯仿法提取DNA，设计MMACHC基因5个外显子的引物，然后进行PCR扩增，其产物直接测序检测突变。

　　三、治疗与随访观察

　　急性期限制天然蛋白质摄入，每天小于1.5g/kg，同时给予特殊奶粉（不含缬氨酸、苏氨酸、蛋氨酸及异亮氨酸）治疗，以便保证营养。给予VitB12，1mg/d，肌注，连续3天；左旋肉碱100～300mg g kg-1 d-1，静滴或口服。长期维持治疗给予维生素B12，每周肌内注射1mg，1~2次；甜菜碱500～1000mg/d、叶酸10～30mg/d和维生素B6 10～30mg/d。部分患儿加用左旋肉碱 250~1000mg/d、特殊奶粉治疗（1.0~1.5g kg-1 d-1）。每1～3个月门诊随访1次，治疗期间定期复查有关检查。

　　四、资料分析  采用SSPS 13.0 统计软件进行统计学分析，MS/MS检测结果采用均数±标准差（X±S）表示，GC-MS检测结果采用中位数表示，比较均采用秩和检验，以PA纯合突变，5例为609G>A伴658_660delAAG、567_568insT、394C>T 和217C>T杂合突变。658_660delAAG和567_568insT突变国内外尚未见报道，50例健康人中未检测到这2种突变。此外，检测出3种基因多态性，即-302T>G、-234A>G及321G>A，参照PubMed中SNP数据库，证实分别为rs3748643、rs3728644、rs2275276。

　　讨  论

　　甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症临床特征以神经系统症状为主，尤其是脑损伤，大多位于双侧苍白球，可表现为嗜睡、惊厥、运动功能障碍以及手足徐动症等。部分患儿伴巨幼红细胞性贫血、粒细胞及血小板减少[5]，严重时出现骨髓抑制。部分患儿伴肝肾损伤，肾小管酸中毒、间质性肾炎、慢性肾衰等肾脏衰竭，有时伴有溶血性尿毒症综合征[6,7]。迟发型患儿多在4 岁~14岁出现症状，甚至于成年期起病，常合并脊髓、肝、肾、眼、血管及皮肤等多系统损害，儿童或青少年时期表现为急性神经系统症状，如认知能力下降、意识模糊及智力落后等 [7-9]。本研究中14例患儿主要表现为呕吐、抽搐、嗜睡、纳差、智力落后、肌张力低下、运动发育迟缓、小头畸形和肝肿大。实验室检查主要有较难纠正的酸中毒、血清同型半胱氨酸升高、血红蛋白降低、平均红细胞压积增大、中性粒细胞和血小板减少、血氨及乳酸升高等。头颅核磁共振显示不同程度的脑损害及脱髓鞘病变。故对于出现上述临床表现和实验室异常的患者需要及时留取血样和尿样进行串联质谱和气相色谱-质谱检测，以便尽早诊断和治疗。

　　串联质谱和气相色谱-质谱技术是诊断本病的可靠方法[10,11]，MMA患者血中C3增高，可通过串联质谱技术进行检测，并可计算C3/C0、C3/C2比值，减少假阳性。因丙酸血症也表现为C3增高，故这2种疾病通过串联质谱检测难以鉴别，依据我们的经验，若伴有甘氨酸增高者提示丙酸血症，甘氨酸正常或降低者提示MMA[12]。本研究中大多患儿的C3、C3/C0与C3/C2明显高于正常上限，但2例患儿C3水平正常或略高于正常上限，但C3/C0与C3/C2比值较高。这主要由于部分患儿在急性期常常因呕吐或食欲差，肉碱摄入减少，C3值可能低于上限值，但C3/C0或C3/C2值仍增高，提示C3/C0与C3/C2比值对甲基丙二酸血症的诊断更有价值[12,13]。气相色谱-质谱技术主要检测尿中50余种有机酸水平，包括甲基丙二酸、3-羟基丙酸和甲基枸橼酸等，对诊断本病具有特异性，并有助于MMA与丙酸血症的鉴别。但对于尿中甲基丙二酸轻度增加的患儿，需结合串联质谱检测结果进行判断。因为在其他疾病导致的酸中毒时尿中甲基丙二酸也会轻度增高，但血中C3、C3/C0和C3/C2正常，故两种技术结合更有助于甲基丙二酸血症的诊断和鉴别诊断。维生素B12负荷试验用于判断是否为B12有效型MMA，有利于指导治疗。伴血同型半胱氨酸增高者，诊断为MMA合并同型半胱氨酸血症。另外，可利用气相色谱-质谱技术检测妊娠16～18周羊水中的甲基丙二酸，或对羊水中胎儿细胞的DNA进行基因突变检测进行产前诊断[14]。

　　本病的治疗药物主要包括维生素B12、左旋肉碱、甜菜碱、叶酸和VitB6，部分患儿不需要限制天然蛋白质摄入，部分患儿需要限制天然蛋白质摄入，给予不含异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸的奶粉治疗。维生素B12和甜菜碱需长期维持治疗，维生素B12肌注效果优于口服，更能有效地降低同型半胱氨酸以及甲基丙二酸的水平[15]。甜菜碱、叶酸以及维生素B6治疗可降低同型半胱氨酸水平。

　　基因突变研究显示突变类型具有明显的种族差异，Lerner-Ellis 对250例不同地区的cb1C 型患者检测显示271dupA（R91KfsX14）突变频率较高（40%），主要见于欧洲人；394C>T见于11例印第安、巴基斯坦或中东患儿；609G>A在5例东亚患儿中检出[18]。近来对基因型与临床表现型的关系研究表明271dupA多见于早发型患儿，而394C>T则多为迟发型患儿[17,18]。本研究在14例中国患儿中发现609G>A突变频率为62.7%，217C>T与394C>T突变各检测到1例，且为伴609G>A突变的杂合突变，表明609G>A为中国患儿的热点突变。另外检测到2种新突变，其中658_660delAAG突变造成蛋白质翻译时第220位赖氨酸缺失；567_568insT突变造成从第190位异亮氨酸开始发生移码突变。

　　综上所述，MMA合并同型半胱氨酸血症以cblC型最常见，诊断主要依据串联质谱检测血C3水平、C3/C0和C3/C2比值，气相色谱-质谱检测尿甲基丙二酸，以及血同型半胱氨酸水平测定。患儿对维生素B12、甜菜碱、左旋肉碱、叶酸和VitB6具有较好的疗效。基因突变检测提示609G>A为中国患儿最常见突变类型，有助于今后患儿基因突变检测及产前诊断。

　　参考文献

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　　表1  患儿治疗前后血液中丙酰肉碱(C3，mmmol/L)水平及丙酰肉碱与游离肉碱比值(C3/C0)、丙酰肉碱与乙酰肉碱比值(C3/C2)变化(x±s)

　　Table1  The changes of acylcarnitine(C3, mmmol/L), and rations with free carnitine (C3/C0) and acetylcarnitine(C3/C2 )in the bood before and after treatments(x±s)

　　                                                            C3                     C3/C0               C3/C2

　　参考值 (Reference value)                      A   

　　2             609G>A             W203X                                                                609G>A            609G>A

　　3             609G>A             W203X         656_658delAGA*       Q219?        656_658delAGA      609G>A

　　4             609G>A             W203X                                                                609G>A            609G>A

　　5             609G>A             W203X                394C>T             R132X             609G>A            394C>T

　　6             609G>A             W203X                                                                609G>A            609G>A

　　7             609G>A             W203X          656_658delAGA        Q219?       656_658delAGA      609G>A

　　8             609G>A             W203X                                                                609G>A            609G>A

　　9             609G>A             W203X            567_568insT*         I190？             609G>A         567_568insT

　　10            609G>A             W203X                                                               609G>A            609G>A

　　11            609G>A             W203X                217C>T              R73X              609G>A            217C>T

　　12            609G>A             W203X                                                                609G>A            609G>A

　　13        仅检测到多态性

　　14               未测出

　　注：*为检测到新突变(* present novel mutations detected)